Структура комплекса нуклеазы Cas9 с направляющей РНК
Международная группа ученых из России и США обнаружила фермент, который способен специфически уничтожать нужную РНК с помощью РНК-гида. Нуклеаза входит в одну из разновидностей системы CRISPR, однако, в отличие от широко известных CRISPR/Cas9, действует на уровне РНК, а не ДНК, что избавляет весь метод от риска дестабилизации генома из-за внесения «неправильных» разрывов. Работа пока не прошла рецензирование и доступна в виде препринта в базе bioarXiv.org
Созданная в 2012 году система редактирования генома CRISPR/Cas9 основана на системе бактериального противовирусного иммунитета. Такой иммунитет позволяет бактериям находить фрагменты ДНК вируса в своей «картотеке» CRISPR (она расположена в определенном участке генома бактерии), и уничтожать вирусную ДНК с помощью специальной нуклеазы.
У разных бактерий и архей существует несколько типов системы CRISPR и несколько нуклеаз, однако для целей редактирования генома в биоинженерии почти всегда используется нуклеаза Cas9 (это отражено в названии метода). Главное преимущество именно этой нуклеазы в том, что Cas9 работает самостоятельно (это один белок), в то время как большинство остальных нуклеаз CRISPR работают в комплексе из нескольких ферментов, а использовать мультисубъединичные комплексы для редактирования генома неудобно и часто неэффективно.
У системы CRISPR/Cas9 есть три ключевых недостатка. Во-первых, нуклеаза Cas9 — довольно большой белок, ген которого часто не «влезает» в те носители (векторы), что используются для введения генетических конструкций в клетках.
Во-вторых, Cas9 действует только на ДНК, а не РНК. Это нельзя назвать недостатком если мы действительно хотим редактировать геном клетки, то есть менять ее ДНК. Однако часто нужного результата можно добиться просто «выключив» активность нужного гена на уровне РНК — просто уничтожив все сделанные с этого гена копии. Такое вмешательство, известное по примеру РНК интерференции, потенциально более безопасно, так как не вносит нестабильности в геном. Например, если даже нуклеаза ошибается в выборе мишени, это никак не ведет к появлению мутаций в геноме. Такой метод потенциально может быть ближе к терапевтическому применению, чем настоящее редактирование генома с помощью CRISPR/Cas9.
В-третьих, сейчас метод редактирования генома CRISPR/Cas9 является предметом патентного спора, что может существенно отложить его приход в клиническую практику. Все эти причины требуют поиска новых нуклеаз, которые можно было бы использовать для регуляции активности генов.
Ранее этой же группе исследователей удалось создать биоинформатическую систему поиска новых видов иммунитета CRISPR в геномных данных бактерий и найти новый класс систем CRISPR, том числе гипотетическую нуклеазу С2с2. Это небольшой белок, который, как показывал анализ последовательности, скорее всего действует не на ДНК, а на РНК.
В новой работе ученым удалось подтвердить эти предположения и опробовать новую систему CRISPR/C2c2 в действии. Для этого авторы перенесли последовательности CRISPR, C2c2 и других компонентов системы из лептотрихии (Leptotrichia shahii), в геноме которой ее обнаружили, в геном кишечной палочки. Затем ученые заражали бактерий РНК-вирусом MS2 и смотрели на выжившие клетки. Таким образом удалось обнаружить фрагменты вируса, которые наиболее всего уязвимы для действия CRISPR/C2c2 и определить субстратные предпочтения фермента C2c2.
В качестве теста биоинженерных свойств системы CRISPR/C2c2 авторы научились выключать красное свечение бактерий за счет уничтожения РНК предварительно введенного в клетки гена красного флюоресцентного белка. По словам ученых, эффективность выключения составила от 20 до 92 процентов, в зависимости от выбранной мишени на РНК флюоресцентного белка.
Такая эффективность сравнима с эффективностью РНК-интерференции, которая работает сходным образом, но за счет других молекулярно-биологических механизмов. У РНК-интерференции при этом есть собственные недостатки. Например, короткие РНК, которые вводятся в клетки для выключения генов, очень быстро уничтожаются неспецифичными РНКазами и часто не могут проникнуть в клетку, из-за чего терапевтическая эффективность существенно снижается.
23.05.2016 Источник: Александр Ершов nplus1.ru
